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　　ELISA操作指南：從板子準備到結果分析

　　以下是ELISA實驗從板子準備到結果分析的完整操作指南，結合高可信度來源和富媒體資源整理：

　　一、實驗前準備

　　試劑與耗材?

　　需準備包被板、標準品、生物素化抗體、酶標二抗、TMB顯色液及終止液等?

　　試劑需室溫平衡1小時，凍存樣本需4℃緩慢解凍?

　　樣本處理?

　　血清/血漿需3000×g離心15分鐘去除纖維蛋白，細胞上清需0.22μm過濾?

　　建議進行預實驗確定最佳稀釋比例(通常5-10倍梯度稀釋)?

　　二、實驗操作流程

　　包板與封閉?

　　用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋抗原/抗體(1-10 μg/mL)，每孔加100μL，4℃過夜或37℃孵育2小時?

　　封閉液推薦5% BSA或脫脂奶粉，室溫孵育1-2小時?

　　加樣與孵育?

　　標準品需2倍稀釋系列(如640pg/ml至0pg/ml)，每濃度設2個復孔

　　樣本與標準品加樣需在15分鐘內完成，37℃孵育30-60分鐘?

　　洗滌關鍵步驟?

　　每孔加300μL洗滌液，震蕩浸泡1-2分鐘，重復3-5次，拍干時避免液體殘留?

　　三、顯色與讀數

　　顯色反應?

　　每孔加100μL TMB底物，避光孵育5-30分鐘(顯色梯度需肉眼觀察)?

　　終止液(如2M硫酸)加入后15分鐘內用酶標儀測450nm吸光值?

　　結果分析?

　　標準曲線需R2>0.99，樣本OD值需在標準曲線線性范圍內?

　　陽性判定：樣本OD值>陰性對照2.1倍?

　　常見問題處理

　　高背景?：可能因洗滌不充分或封閉不足，需增加洗滌次數或更換封閉液?

　　顯色異常?：檢查底物有效期或孵育時間，避免氣泡干擾?

　　注：以上僅供參考，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。

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